Virus viêm gan B có khả năng lây truyền mạnh hơn từ 50 tới 100 lần so với virus gây suy giảm miễn dịch ở người (human immunodeficiency virus – HIV) – loại virus gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (acquired immunodeficiency syndrome – AIDS). Những người nhiễm virus viêm gan B mạn tính là những người có kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B (hepatitis B surface antigen – HBsAg) trong huyết tương tồn tại kéo dài từ 6 tháng trở lên, và đây là nguồn lây truyền chính của virus viêm gan B.
Virus viêm gan B lây truyền bằng cách máu hoặc dịch cơ thể có chứa virus tiếp xúc trực tiếp với niêm mạc, với các chỗ da không toàn vẹn hoặc qua con đường xuyên qua da. Virus viêm gan B có nồng độ cao nhất trong máu, và đường lây truyền xuyên qua da (chẳng hạn như sử dụng kim tiêm) là một trong những cách lây truyền phổ biến nhất. Tinh dịch, dịch tiết âm đạo cũng là những loại dịch có thể gây lây nhiễm, ngoài ra virus viêm gan B còn có thể được tìm thấy trong nước bọt, nước mắt, dịch mật.
Dịch não tủy, dịch khớp, dịch màng phổi, dịch màng bụng, dịch màng tim, và dịch ối cũng được coi là có nguy cơ gây lây nhiễm. Phân, nước tiểu, chất nôn, dịch rửa tỵ hầu, đờm và mồ hôi có số lượng virus không nhiều nên hiếm khi có nguy cơ lây truyền, trừ khi chúng có lẫn máu. Sữa mẹ cực kì hiếm gây lây nhiễm, do đó nhiễm virus viêm gan B không phải là chống chỉ định đối với nuôi con bằng sữa mẹ.
Thống kê trên người trưởng thành ở Hoa Kỳ cho thấy virus viêm gan B lây truyền chủ yếu bằng con đường phơi nhiễm xuyên qua da (chẳng hạn như tiêm chích ma túy) và quan hệ tình dục. Virus viêm gan B lây truyền dễ dàng qua quan hệ tình dục khác giới và quan hệ tình dục đồng giới nam. Yếu tố nguy cơ của lây truyền qua quan hệ tình dục khác giới bao gồm quan hệ tình dục không an toàn với người đã bị lây nhiễm, quan hệ tình dục không an toàn với nhiều người, và có tiền sử đã mắc một bệnh lây truyền qua đường tình dục (sexually transmitted infection – STI) khác.
Sự lây nhiễm virus viêm gan B cũng có thể xảy ra từ những tiếp xúc cá nhân (ví dụ như dùng chung dao cạo, bàn chải đánh răng, tiếp xúc với dịch tiết từ các tổn thương da, hoặc tiếp xúc với các vật thể bị nhiễm kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B). Các đường lây truyền có thể gặp khác là qua truyền máu và chế phẩm từ máu (hiếm gặp vì các sản phẩm này đã được sàng lọc và trải qua quá trình xử lý), các dụng cụ y tế bị ô nhiễm mà không được xử lý thích hợp, tiêm truyền không đảm bảo vô khuẩn, ghép tạng,…